臨研所、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛(ài)民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床**診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持。王愛(ài)民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無(wú)限制行為動(dòng)物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來(lái)即時(shí)病理、離體組織檢測(cè)、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無(wú)須使用孔限制光學(xué)散射。美國(guó)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng)；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快。目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82?m，y軸的橫向分辨率為0.35?m。美國(guó)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮**。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢(shì)，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺(tái)式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場(chǎng)顯微鏡。采用雙軸對(duì)稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素），同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬(wàn)線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對(duì)腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動(dòng)的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時(shí)采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號(hào)的接收，解決了動(dòng)物的活動(dòng)和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來(lái)，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時(shí)，精細(xì)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動(dòng)。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。

其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或意義不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來(lái)說(shuō)，觀察時(shí)，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開(kāi)來(lái)。如果兩個(gè)相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大很大程度，也可能看到兩個(gè)相交的亮點(diǎn)(艾里斑)，沒(méi)有明顯的邊界(更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了)，說(shuō)明分辨率不夠。沒(méi)有分辨率談放大是沒(méi)有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長(zhǎng)的一半。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限，但準(zhǔn)確的說(shuō)應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種，被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間，即可得到真實(shí)的晶體表面像。雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有。美國(guó)激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。美國(guó)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

從雙光子的原理和特點(diǎn)，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源，因此該波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷很小，適合長(zhǎng)期研究；☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比，可見(jiàn)光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng)，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問(wèn)題；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)處體積約為波長(zhǎng)三次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處，焦點(diǎn)外的區(qū)域不會(huì)發(fā)生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片(共焦)，提高了熒光收集率，直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高；☆圖像對(duì)比度高:由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng)，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā)，因此可以用來(lái)對(duì)生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像；美國(guó)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商